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轉譯起始時43S起始前複合物會自mRNA的5′往3′移動以尋找起始密碼子，遇到uORF的起始密碼子時即會開始轉譯，轉譯uORF時核糖體可能發生停滯（並啟動无义介导的mRNA降解），或在結束轉譯後脫離mRNA，不再繼續轉譯下游的主要ORF，因此抑制主要ORF的基因表現，40S核糖体亚基也可能在完成uORF的轉譯時繼續結合在mRNA上並往3′移動，找到主ORF的起始密碼子並重新啟動轉譯[5]。長度較長、距主要ORF較近或具核酸二級結構而促使核糖體停滯的uORF較易抑制主ORF的轉譯[5]。

43S起始前複合物尋找起始密碼子時，某些情況下也會跳過uORF，直接轉譯主要的開放閱讀框，此機制與uORF的位置與周邊序列有關[5]。另外許多uORF的起始密碼子並非AUG，而是其他類似的密碼子，其中以CUG最多，其次為GUG（約與AUG數量相等），再次為UUG[5]。

uORF轉譯生成的多肽產物可由質譜儀測得[6]，其中有些可參與轉譯調控，或與細胞中其他蛋白結合而影響其他反應[5]。