南方墨點法

萨瑟恩杂交是利用标记的探针（probe）与转印膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测DNA片段中是否存在与探针同源的序列。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测。

1. 从细胞或组织中用酚/氯仿反复抽提蛋白质并用无水乙醇沉淀的方法制备基因组DNA(gDNA)；
2. 限制性酶切基因组DNA；
3. 将酶切产物电泳分离(electrophoretic separation)；
4. 毛细转印或电转印并固定于NC膜或尼龙膜上；
5. 在膜上与标记探针杂交；
6. 洗膜后可观察杂交结果。

• 将新鲜组织研磨成匀浆收集细胞或培养好的细胞用胰酶处理后收集，先反复用酚处理细胞两次后，加入氯仿抽提蛋白质。用乙酸铵和无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗涤一次，加入TE缓冲液溶解。在用琼脂糖凝胶电泳确认基因组DNA成功提取后，加入限制性内切酶消化，过夜反应。

• 制备0.8%-1.0%的凝胶，用0.5*TBE作电泳缓冲液，根据胶的长度，在1V/cm的电压下电泳，至上样缓冲液(如溴酚蓝等)到达特定位置停止。

• DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免DNA降解。
• 将凝胶在脱嘌呤液中浸泡20min(视靶序列是否大于5kb，若大于则需要此步骤)，室温轻轻晃动至溴酚蓝从蓝变黄。洗涤一次后在变性液中浸泡30min,再在0.5*变性液中浸泡20min，即可进行萨瑟恩转印。

这里介绍两种常用的转印方法：毛细转印和电转印法。

早期萨瑟恩印迹法是使用毛细转印法，经虹吸作用，转移到NC(硝酸纤维)膜上。

1. 在搪瓷盘中加入300ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板；
2. 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡；
3. 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶走滤纸与胶之间的气泡；
4. 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡；
5. 紧贴凝胶四周各放一张X光片；
6. 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动；
7. 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜；
8. 整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10cm；
9. 在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜。

转印法经过改良后，快速简便的电转印法如今应用的更加普遍。

1. 将胶平放于干净投影胶片上；
2. 裁剪一张与胶同大小的尼龙膜或NC膜，用0.5*TBE浸湿后小心平铺在胶表面，用玻璃棒除去凝胶和膜之间的气泡；
3. 裁剪6张同样尺寸的滤纸，用0.5*TBE浸湿后平铺于膜上，用玻璃棒去除气泡；
4. 在胶的另一面同样铺上6层0.5*TBE浸湿的滤纸，除气泡；
5. 将“滤纸-尼龙膜(NC膜)-凝胶-滤纸”转印装置移入电转印仪中，使膜面向阳极，凝胶面向阴极，室温下，100mA转印60min。

• 取出膜在2*SSC中浸泡20min。将膜DNA面朝上置于滤纸上，再覆盖一张滤纸，60℃烤膜30min。

• 将膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭4-6小时。倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。再将膜放在洗膜溶液I(2*SSC、0.1%SDS)中,室温洗2次,每次摇动10min。再在洗膜溶液II(0.5*SSC、0.1%SDS)中漂洗2次, 每次摇动20min。

1. 将膜在洗膜缓冲液中漂洗3分钟；
2. 在封闭缓冲液中室温摇动封闭30分钟；
3. 在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟；
4. 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟；
5. 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时；
6. 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE洗去底物液，干燥保存。

1. 浓度越大，复性速度越快，敏感性越高；
2. 分子越大，转膜越困难，敏感性越低；
3. 转膜方法

1. 对于单链探针，浓度越高，杂交率增加；
2. 探针标记方法和检测方法的选择；

1. 体积越小，杂交动力学越高；
2. DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃；
3. 温度越低，非特异性越高；温度越高，敏感性越低；

1. 低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加(Na+的作用)；
2. 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完全同源的杂交时，必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐浓度；

杂交前封闭膜上非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异吸附。

盐浓度、温度、次数、体积

阳离子尼龙膜