新超级马力欧兄弟U

• 瑪利歐

本作的第一角色、在本作外傳新超級路易吉U中則不會出現。

• 路易吉

本作的第二角色、在本作外傳新超級路易吉U則改為第一角色擔當。

• 奇諾比奧

繼承前作Wii的新超級瑪利歐兄弟Wii登場、以藍色與黃色的奇諾比奧兄弟為第三/四設計的可選擇角色。
在外傳的新超級路易吉U中，則會以玩家可使用的第二及第三角色身份登場。
在任天堂Switch的豪華版中則將黃色奇諾比奧和藍色奇諾比奧合二為一成為第三（本篇）/第二（外傳）角色。開始選擇角色時只會出現黃色奇諾比奧，如果要切換至藍色奇諾比奧，則需要按住控制器的L鍵並同時按下A確認鍵即可使用藍色奇諾比奧。

• 奇諾比珂

在任天堂Switch的豪華版中作為追加角色登場並成為第四（本篇）/第三（外傳）角色。
可以透過獨特的道具"超級皇冠"變身轉化為奇諾比姬公主形態，可以跳躍後短暫浮空及掉到空隙/岩漿時可即時返場。

• 偷天兔

在WiiU的本傳中作為亂入的競爭對手登場，會跟玩家競速搶奪目標物件。
在外傳的新超級路易吉U中，則會以玩家可使用的第四角色身份登場，可免受傷害行動，但掉入空隙/岩漿依然會失去生命。
在任天堂Switch的豪華版中，偷天兔可在包括本篇和外傳在內的所有關卡中以可遊玩角色使用，並且與Wii U外傳同樣可無視場地或敵人襲擊行走。

• Mii

在WiiU版本中在故事模式以外的「with Miiモード」可以自定義作為玩家角色使用。
在任天堂Switch的豪華版中亦可在如計時賽等模式中使用。