蛋白酶体

不同的生物体中，20S核心颗粒中亚基的数量和差异性都有所不同；就亚基数量而言，多细胞生物比单细胞生物要多，真核生物比原核生物多。所有的20S颗粒都由四个堆积的七元环所组成，这些环结构则是由两种不同的亚基构成：α亚基为结构性蛋白，而β亚基则发挥主要的催化作用。外部的两个环，每个环都含有七个α亚基，一方面作为调节颗粒的结合部，另一方面发挥“门”的作用，阻止蛋白质不受调控地进入核心颗粒的内部。内部的两个环，每个环都含有七个β亚基，且包含蛋白酶活性位点，用于蛋白质水解反应。蛋白酶体的大小在不同物种之间相当保守，其长和宽分别为约150 Å和115 Å。其内部孔道宽为近53 Å，而入口处则只有13 Å的宽度，这就提示蛋白质要进入其中，需要先被至少部分去折叠。[12]

在古菌（如Thermoplasma acidophilum）中，所有的α亚基和所有的β亚基是等同的；而真核生物的蛋白酶体（如酵母）中，每个亚基都不相同，即α和β亚基都含有七种不同的亚基。在哺乳动物中，β1、β2和β5亚基具有催化作用；虽然它们有着共同的催化机制，但它们具有不同的底物特异性，分别为类胰凝乳蛋白酶型、类胰蛋白酶型和肽谷氨酰基肽水解。[13]在暴露于前炎症信号（如细胞因子，特别是γ干扰素）时，细胞应激反应会促使造血细胞表达另一些形式的β亚基，即β1i、β2i和β5i。由这些替代亚基所组装成的蛋白酶体又被称为“免疫蛋白酶体”（immunoproteasome），相对于正常形式的蛋白酶体，其底物特异性发生了变化。[12]

真核生物中的19S颗粒是由19个蛋白质组成的，并可以被分成两个部分：一个由10个蛋白质组成的可以与20S核心颗粒上的α环直接结合的基底，和一个由9个蛋白质组成的结合多泛素链的盖子。其中，10个基底蛋白质中的6个具有ATP酶活性。19S和20S颗粒的结合需要ATP先结合到19S颗粒上的ATP结合位点。[14]ATP的水解对于蛋白酶体降解一个连接泛素的紧密折叠的蛋白质是必不可少的，而ATP水解所产生的能量主要是用于蛋白质的去折叠[15]、核心颗粒的孔道开放[16]还是两者皆有[14]，则还不清楚。截止到2006年，26S蛋白酶体的结构还没有获得解析。[16]

19S颗粒的每个组分都有它们自己的调控作用。一个近期鉴定出的癌蛋白Gankyrin是19S颗粒的组分之一，可以与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4紧密结合，并且通过与泛素连接酶MDM2的结合，在识别泛素化的P53蛋白中发挥作用。Gankyrin具有抗凋亡作用，其被发现在一些类型的肿瘤细胞（如肝癌细胞）中过表达。[17]

20S核心颗粒也可以与第二种调节颗粒，即11S颗粒相结合。11S调节颗粒又被称为PA28或REG。它是七聚体结构，不包含任何ATP酶，能够促进短肽而不是完整的蛋白质的降解。这可能是因为由11S颗粒与核心颗粒所组成的复合物无法将大的底物去折叠。11S颗粒的调控机制与19S颗粒的机制类似，是通过其亚基的C末端结合核心颗粒，并诱发α环发生构象变化，从而打开20S核心颗粒的“门”，使得底物蛋白质可以进入核心颗粒。[18]11S颗粒的表达受γ干扰素的诱导，并且负责与免疫蛋白酶体的β亚基一起生成结合到主要组织相容性复合体上的肽段。[11]

11S和19S调节颗粒都是多亚基的复合物，而实际上真核生物中还存在着以单个蛋白结合20S颗粒的调节蛋白──PA200或Blm10（酵母中）。PA200的分子量高达200kDa，其主要定位于细胞核中，可以直接结合并激活20S颗粒。[19][20]PA200可能参与了DNA双链断裂的修复。[20]

泛素卡通模型

需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接。这一过程是一个三酶级联反应，即需要有由三个酶催化的一系列反应的发生，整个过程被称为泛素化信号通路。在第一步反应中，泛素活化酶（又被称为E1）水解ATP并将一个泛素分子腺苷酸化。接着，泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。[24]被腺苷酸化的泛素分子接着被转移到第二个酶，泛素交联酶（E2）的半胱氨酸残基上。最后，高度保守的泛素连接酶（E3）家族中的一员（根据底物蛋白质的不同而不同）识别特定的需要被泛素化的靶蛋白，并催化泛素分子从E2上转移到靶蛋白上。靶蛋白在被蛋白酶体识别之前，必须被标记上至少四个泛素单体分子（以多泛素链的形式）。[25]因此，是E3使得这一系统具有了底物特异性。[26]E1、E2和E3蛋白的数量依赖于生物体和细胞类型，人体中就存在大量不同的E3蛋白，这说明泛素-蛋白酶体系统可以作用于数量巨大的靶蛋白。

多泛素化后的蛋白质是如何被蛋白酶体所识别的，还没有完全弄清。泛素受体蛋白的N末端具有一个类泛素结构域，以及一至多个泛素结合结构域。类泛素结构域可以被19S调节颗粒所识别，而泛素结合结构域可以通过形成三螺旋束来结合泛素。这些受体蛋白可能能够结合多泛素化的蛋白质并将其携带到蛋白酶体，而关于这种结合的特异性和调控机制还不清楚。[27]但最近有研究者发现，调节颗粒上的亚基Rpn13可以发挥泛素受体的功能。[28][29]

泛素蛋白自身由76个残基所组成，以“泛素”为名是因为它在生物体中广泛存在：具有高度保守的序列并且存在于所有已知的真核生物体中。真核生物中编码泛素的基因以串联重复的方式排列，这可能是因为大量转录的需要，为细胞生产足够多的泛素。有人提出泛素是目前发现的进化速度最慢的蛋白质。[30]

泛素化信号通路。其中，“Ub”表示泛素。

泛素化后的蛋白质（以下称为底物蛋白）被19S调节颗粒所识别，这一过程是一个ATP依赖的结合过程。[14]然后，底物蛋白必须进入20S核心颗粒的内部孔道，以便与位于其中的水解活性位点接触。由于20S颗粒的孔道相对狭窄，而且两端由α环中亚基的N末端控制开关，所以底物蛋白在进入核心颗粒之前必须至少部分去折叠。将去折叠的蛋白质传递进入核心颗粒的过程被称为“移位”（translocation），而移位必须发生在去泛素化之后。[14]但目前对于底物蛋白的去泛素化和去折叠机制还不了解。[31]在整个降解反应过程中，那一步是限速步取决于底物蛋白的类别；对于一些蛋白质，去折叠过程是限速步，而对于另一些蛋白质，可能是去泛素化为限速因子。[15]至于哪些底物蛋白在移位之前必须去折叠，还未有结论，而牢固的三级结构和一些特殊的非局部相互作用，如二硫键，能够抑制降解。[32]

由α亚基所形成的“门”可以阻止长于四个残基的多肽进入20S颗粒的内部。在识别步骤开始前结合上的ATP分子在移位发生前被水解，而对于水解产生的能量是用于蛋白质去折叠[15]还是“门”的打开[16]还有争议。26S蛋白酶体在存在无法水解的ATP类似物（即无法获得水解产生的能量）的情况下，依然可以降解去折叠的蛋白质，但却无法降解折叠的蛋白质；这一结果说明ATP水解所产生的能量至少部分被用于蛋白质去折叠。[33]在19S帽子处于ATP结合状态时，去折叠的底物蛋白可以由促进扩散作用，传递通过开启的“门”。[34]

球蛋白去折叠的机制是基本类似的，但在一定程度上也取决于蛋白质的氨基酸序列。研究者发现含有较长的甘氨酸或丙氨酸序列可以抑制去折叠，从而降低蛋白酶体的降解效率；其结果是生成含有部分去折叠蛋白质的混合物，这可能是由于ATP水解和去折叠步骤之间的脱节所导致的。[35]自然界中的一些蛋白质也有这样的甘氨酸-丙氨酸重复序列存在，如蚕丝中的丝心蛋白；值得一提的是，特定的人類疱疹病毒基因的表达产物也含有这样的序列，通过抑制蛋白酶体的作用，阻止了抗原呈递到主要组织相容性复合体上，从而有助于病毒的繁殖。[36]

20S核心颗粒的一个剖面图，显示了活性位点的位置。其中，α亚基用绿色的球来表示，β亚基的蛋白骨架显示为飘带，并且不同的多肽链用不同的颜色表示。小的粉色球表示每个亚基的活性位点中苏氨酸残基的位置。淡蓝色的化学结构为结合在活性位点上的抑制剂硼替佐米。

蛋白质的降解由20S核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击。这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化。降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道裡，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段；肽段的长度一般为7-9个残基，但根据生物体和底物蛋白的不同，长度范围可以从4-25个残基不等。决定分解产物中肽段长度的机制，目前还没有完全弄清。[37]虽然具有催化活性的三个β亚基具有共同的降解机制，但它们对于底物的特异性却略有不同，分别为类胰凝乳蛋白酶型、类胰蛋白酶型和肽谷氨酰基肽水解型。这种对于底物特异性的差异是来自于靠近活性位点的局部残基与底物之间的相互作用的不同。每一个具有催化活性的β亚基也都含有一个降解所必需的保守的赖氨酸。[13]

虽然蛋白酶体通常生成非常短的降解片断，但在一些情况下，这些降解产物自身是具有生物学活性的功能分子。特定的转录因子，包括哺乳动物的NF-κB复合物中的一个组分，合成后是以无活性的前体分子存在，在经过泛素化和蛋白酶降解后，才转变为活性分子。这种降解需要蛋白酶体剪切蛋白质的中间部分，而不是通常情况下的从蛋白质的一端开始的剪切。有人提出，需要被剪切的中间部分为一个长的环，位于蛋白表面，从而可以作为蛋白酶体的底物进入其内部孔道，而蛋白质的其他部分依然在孔道外，并不会被降解。[38]在酵母蛋白中也发现了类似的现象；这种选择性降解被称为“受调控的泛素-蛋白酶体依赖的剪切”（regulated ubiquitin/proteasome dependent processing）。[39]

虽然大多数的蛋白酶体的底物必须在降解之前被泛素化，但仍然有一些例外的情况，尤其是在蛋白酶体参与蛋白质的翻译后处理过程中。一个主要的例子是蛋白酶体通过将p105蛋白剪切为p50蛋白来激活NF-κB。[38]一些由于存在无结构区域而被推测具有不稳定性的蛋白质也可以通过非泛素依赖的途径被降解。[40]鸟氨酸脱羧酶是最著名的非泛素依赖途径中蛋白酶体的底物。[41]对于关键的细胞周期调控因子，如P53蛋白的非泛素依赖的降解机制已经有报道，虽然p53蛋白也可以通过泛素依赖的途径被降解。[42]此外，在一定的细胞应激条件下，结构不正常、错误折叠或者过度氧化的蛋白质也都会进入非泛素依赖的和非19S颗粒依赖的降解途径。[43]

细胞周期进程是由一系列细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）来进行调控的，而CDK则是由细胞周期蛋白（cyclin）来激活。有丝分裂的细胞周期蛋白，在细胞中只有几分钟寿命，是所有已知的细胞内蛋白中寿命最短的。[1]在CDK-cyclin复合物行使了它的功能之后，复合物中的cyclin就会被多泛素化并由蛋白酶体降解，从而保证了细胞周期的正常运转。尤其是在细胞退出有丝分裂期时，作为调控组分的周期蛋白B需要从有丝分裂促进因子上脱落下来，而这一解离过程依赖于蛋白酶体的参与。[46]

细胞周期检控点，如G₁期和S期之间的后限制点检查，也需要蛋白酶体降解周期蛋白A，而cyclin A的泛素化由一个名为后期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）的E3泛素连接酶来进行。[47]APC蛋白和Skp1/Cul1/F-box蛋白复合物（即SCF复合物）是降解cyclin和控制检控点的两个关键调控因子；SCF复合物自身则由APC蛋白来调控，由于Skp2蛋白（SCF复合物中的转接蛋白）可以在G₁期到S期的过渡期中抑制SCF复合物的活性，因此通过泛素化Skp2蛋白，APC蛋白就可以激活SCF复合物。[48]

在植物中，生長素或植物激素的作用是调控植物生长的方向和向性，它们通过细胞信号通路来诱导一系列转录因子抑制蛋白（Aux/IAA蛋白）进入蛋白酶体降解途径。这些抑制蛋白由SCFTIR1蛋白或者由与auxin受体蛋白TIR1结合的SCF蛋白进行泛素化。Aux/IAA蛋白降解后，对auxin反应因子（ARF）家族的转录因子的抑制就被解除，从而诱导ARF基因的表达。[49]ARF被激活所导致的结果因植物类型和发育水平的不同而有所差异，但都参与了对根和叶脉生长的指导。ARF蛋白和Aux/IAA蛋白之间配对的特异性被认为是ARF的去抑制作用具有反应特异性的原因。[50]

细胞内外的信号都能够诱导细胞凋亡或编程性细胞死亡。其结果是细胞内部的组分发生解构，这主要是由特定的蛋白酶半胱天冬酶来完成，但同时蛋白酶体也可能在细胞凋亡过程中扮演了多种重要角色。蛋白酶体参与细胞凋亡进程的推测是基于凋亡发生前，细胞中泛素化蛋白质以及E1、E2、E3在数量上的增加这一现象；[51][52][53]并且，在细胞凋亡过程中，原本定位于细胞核的蛋白酶体被发现能够移位到调亡小泡的外膜。[54]

蛋白酶体的抑制作用可以影响不同类型细胞的凋亡诱导，在大多数已被研究的细胞类型中，抑制蛋白酶体可以促进细胞凋亡。但一般而言，蛋白酶体并非是细胞凋亡所必需的因子。而且，对于一些细胞系，特别是原代培养的静止和分化的细胞，如胸腺细胞和神经元细胞，暴露于蛋白酶体抑制剂反而阻止了细胞的凋亡。这一作用机制目前还不清楚，但有人推测这种现象只特异性地发生于静止状态的细胞或者这是由于促细胞凋亡激酶JNK的活性差异所导致的。[55]由于蛋白酶抑制剂可以诱发处于快速分裂中的细胞（如癌细胞）的凋亡，因此一些蛋白酶抑制剂已经被开发并作为化疗药品被用于治疗癌症。

蛋白酶体抑制剂硼替佐米的化学结构。采用硼替佐米的化学疗法可以有效地治疗多发性骨髓瘤。

硼替佐米结合于酵母蛋白酶体的核心颗粒上。硼替佐米分子位于图的正中；其中，粉色表示碳原子，蓝色表示氮原子，红色表示氧原子，黄色表示硼原子。环绕在硼替佐米分子周围的是蛋白质局部表面，其中蓝色的部分是发挥催化作用的苏氨酸残基，由于结合上硼替佐米，因而失去了催化活性。

蛋白酶体抑制剂对于人工培养的细胞具有有效的抗肿瘤活性，通过降解受调控的促生长细胞周期蛋白来诱导肿瘤细胞的凋亡。[64]这种可以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡的方法被证明在动物模型以及人体试验中都非常有效。硼替佐米是第一种用作化学治疗药物的蛋白酶体抑制剂，由千年制药公司开发，市场名称为Velcade。[65]硼替佐米主要被用于多发性骨髓瘤的治疗[66]值得一提的是，多发性骨髓瘤会导致血清中蛋白酶体水平的提高，而成功的化疗可以将蛋白酶体的水平恢复到正常范围。[67]动物研究显示硼替佐米可能对死亡率极高的胰腺癌也有显著的临床效果。[68][69]对于硼替佐米在治疗B细胞相关癌症的临床前和早期临床研究已经开始，[70]特别是一些类型的非霍奇金氏淋巴瘤。[71]

利托那韦，市场名称为Norvir，是用于治疗艾滋病的一种蛋白酶抑制剂。近期的研究发现，利托那韦不仅可以抑制蛋白酶，对蛋白酶体也有抑制作用，特别是对类胰凝乳蛋白酶型的蛋白酶体，但对类胰蛋白酶的蛋白酶体则有部分的促进作用。[72]对于动物模型的研究表明利托那韦可能对神经胶质瘤细胞的生长有抑制作用。[73]

将蛋白酶体抑制剂应用于自体免疫性疾病也大有前景。目前这一方面的研究主要是利用动物模型来进行。例如，在对植有人类皮肤的小鼠的研究中发现，用蛋白酶体抑制剂处理过后，原本因患牛皮癬而受损的皮肤所有减少；[74]在一些啮齿动物模型中发现，蛋白酶体抑制剂对于哮喘也有一定的治疗作用。[75]

蛋白酶体的标记和抑制作用也被用于在实验室中针对细胞中蛋白酶体活性所进行的“体外”（in vitro）和“体内”（in vivo）研究。实验室中最常用的抑制剂为乳胞素，一种由链霉菌合成的天然产物。[55]带有荧光基团的抑制剂也已经被开发应用于特异性标记组装好的蛋白酶体上的活性位点。[76]